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BOD5的測定通常采用標準稀釋接種法（HJ 505-2009）。其操作為，經中和及除去毒性物質并經稀釋后的水樣（必要時加入適量含好氧微生物的接種液）置入培養瓶中，20℃避光培養5天，通過測定培養前后水樣中溶解氧的含量，計算出5天內的耗氧量，再根據稀釋倍數得到BOD5。 BOD5的測定是生物和化學作用的共同結果，必須嚴格按照操作規范進行。改變任何一個條件都會影響測定結果的準確性和可比性。影響BOD5測定的條件包括pH值、溫度、微生物種類和數量、無機鹽含量、溶解氧和稀釋倍數等。 用于檢測BOD5的水樣必須裝滿并密封在取樣瓶中，并儲存在2至5°C的冰箱中直至分析。一般應在取樣后6小時內進行檢驗。在任何情況下，水樣的保存時間都不應超過 24 小時。 在測量工業廢水的BOD5時，由于工業廢水通常含有較少的溶解氧，且大部分成分是可生物降解的有機物質，為了保持培養瓶中的好氧狀態，必須對水樣進行稀釋（或接種稀釋），這個操作是標準稀釋法的比較大的特點。為保證測量結果的可靠性，稀釋水樣培養5天后耗氧量必須大于2mg/L，殘留溶解氧必須大于1mg/L。 放入接種液的目的是保證一定量的微生物降解水中的有機物，接種液的量以使5天耗氧0.1mg/L以下為佳。使用金屬蒸餾器制備的蒸餾水作為稀釋水時，應注意檢查其中金屬離子的含量，以免抑制微生物的繁殖和新陳代謝。為保證稀釋水中的溶解氧接近飽和，必要時可通入凈化空氣或純氧，然后置于20℃培養箱中一定時間，以使與空氣中氧分壓達到平衡。 稀釋倍數的確定以培養第5天耗氧量大于2mg/L，剩余溶解氧大于1mg/L為原則。稀釋系數太大或太小都會導致測試失敗。而且由于BOD5的分析周期較長，一旦出現類似情況，也無法原封不動地補充。測量某工業廢水的BOD5時，可先測量其CODCr，然后參考現有水質相近廢水的相關監測數據，初步確定待測水樣的BOD5/CODCr值，然后計算BOD5的大致范圍，并確定稀釋系數。 對于含有抑制或殺滅好氧微生物代謝活動物質的水樣，用普通方法直接測定BOD5的結果會與實際值有偏差，測定前必須進行相應的預處理。這些影響BOD5測定的物質和因素包括重金屬等有毒無機或有機物質、余氯等氧化性物質，pH值過高或過低等。
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