一般BOD5（五日生化需氧量）常用的是稀釋法，選擇原樣品或經適當稀釋的樣品進行測定，然后用適當的倍數進行稀釋。使培養瓶中有足夠的溶解氧以滿足五日生化的需氧要求。將滿足上述條件的樣品分成兩份，一份測定當天的溶解氧質量濃度，另一份放入20攝氏度的培養箱內，培養5天后再檢測溶解氧的質量濃度。這兩種樣品的差就是五日生化需氧量。
對于某些污染嚴重的地面水及大多數工業廢水、生活污水,因含較多的有機物,需要稀釋后再培養測定,以降低其濃度,保證生物降解過程在有足夠溶解氧的條件下進行。其具體水樣稀釋倍數可借助于高錳酸鉀指數或化學需氧量(COD)推算。
對于不含或少含微生物的工業廢水,在測定BOD時應進行接種,以引人能分解廢水中有機物的微生物。當廢水中存在難于被一般生活污水中的微生物以正常速度降解的有機物或含有劇毒物質時,應接種經過馴化的微生物。
稀釋法所用儀器和試劑
(1)恒溫生物培養箱,20L細口玻璃瓶,1000mL量筒,玻璃攪棒(棒長應比所用量筒高度長20cm,在棒的底端固定一個直徑比量筒直徑略小,并帶有幾個小孔的硬橡膠板),200~300mL溶解氧瓶,虹吸管(供分取水樣和添加稀釋水用)。
(2)磷酸鹽緩沖溶液將8.5g磷酸二氫鉀KH2PO4,21.75g磷酸氫二鉀K2HPO4,3.4g磷酸氫二鈉Na2HPO·7H2O和1.7g氯化銨NH4Cl溶于水中,稀釋至1000mL。此溶液的pH為7.2。
(3)硫酸鎂溶液將22.5g硫酸鎂MgSO4·7H2O溶于水中,稀釋至1000mL。
(4)氯化鈣溶液將27.5g無水氯化鈣溶于水,稀釋至1000mL。
(5)氯化鐵溶液將0.25g氯化鐵FeCl3·6H2O溶于水,稀釋至1000mL。
(6)稀釋水在20L玻璃瓶內裝入一定量的蒸餾水,每升蒸餾水中加入氯化鈣溶液、氯化鐵溶液、硫酸鎂溶液、磷酸鹽緩沖溶液各1mL,然后用無油空氣壓縮機或薄膜泵曝氣，使水中溶解氧含量達8~9mg/L時,停止曝氣,蓋嚴,使溶解氧穩定。

如果工業廢水中含有有毒物質,缺乏微生物時,稀釋水中應加適量的經沉淀后的生活污水,作為微生物的接種,通常每升稀釋水接種2mL沉淀污水;或將馴化后的特種微生物引入水樣中進行接種。
(7)測定溶解氧的全部試劑。
稀釋法檢測水中BOD5的操作步驟
1.稀釋水的檢驗
用虹吸法吸取稀釋水(或接種稀釋水),注滿兩個溶解氧瓶,加塞,用水封口。其中一瓶立即測定其溶解氧,另一瓶置于恒溫生物培養箱內,在(20±1)℃培養5d后測定。要求溶解氧的減少量小于0.2~0.5mg/L。
2.稀釋倍數的確定
地面水可由測得的高錳酸鹽指數乘以適當的系數求出稀釋倍數。
工業廢水可由重鉻酸鹽法測得的COD值確定。通常需作三個稀釋比,即使用稀釋水時,由COD值分別乘以系數0.075、0.15、0.225,即獲得三個稀釋倍數,使用接種稀釋水時,則分別乘以0.075、0.15和0.25,獲得三個稀釋倍數。
如無現成的高錳酸鹽指數或COD值資料,一般污染較嚴重的廢水(如工業廢水)可稀釋成0.1%~1%,對于普通和沉淀過的污水可稀釋成1%-5%,生物處理后的出水可稀釋成5%~25%,污染的河水可稀釋成25%~100%
3.稀釋水樣的配制和BOD測定總不可殘
(1)不需經稀釋水樣的測定溶解氧含量較高、有機物含量較少的地面水,可不經稀釋,而直接以虹吸法將混勻水樣轉移至兩個溶解氧瓶內,轉移過程中應注意不使其產生氣泡。以同樣的操作使兩個溶解氧瓶充滿水樣后溢出少許,加塞水封。然后立即測定其中一瓶的溶解氧。將另一瓶放入培養箱中,在(20±1)℃培養5d后。測其溶解氧。
(2)需經稀釋水樣的測定
①一般稀釋法
按照選定的稀釋比例,用虹吸法沿筒壁先引入部分稀釋水(或接種稀釋水)于1000mL量筒中,加入需要量的均勻水樣,再引入稀釋水(或接種稀釋水)至1000mL,用帶膠板的玻璃棒小心上下攪勻。攪拌時勿使攪棒的膠板露出水面,防止產生氣泡。
按不經稀釋水樣的測定步驟,進行裝瓶,測定當天溶解氧和培養5d后的溶解氧含量。含水樣1%以下的稀釋水樣通常采用一般稀釋法。
②直接稀釋法
直接稀釋法是在溶解氧瓶內直接稀釋。在已知兩個容積相同(其差小于1mL)的溶解氧瓶內,用虹吸法加入部分稀釋水(或接種稀釋水),再加入根據瓶容積和稀釋比例計算出的水樣量,然后引入稀釋水(或接種稀釋水)至剛好充滿,加塞,勿使氣泡留于瓶內。其余操作與上述稀釋法相同。
在BOD5測定中,一般采用疊氮化鈉修正法測定溶解氧。如遇干擾物質,應根據具體情況采用其他測定法。
最后根據所得數據進行計算處理，不經稀釋直接培養的水樣可用：BOD5(mg/L)=C1-C2公式計算。經稀釋后培養的水樣可用：BOD5（mg/L）=(C1-C2)-(B1-B2)f1/f2公式計算。
稀釋法檢測水中BOD5時需要注意的問題
(1)對于生化處理后的水中常含有硝化細菌,干擾BOD的測定,可加入硝化抑制劑,如丙烯基硫脲C4H3N2S或用酸處理消除干擾。
(2)在兩個或三個稀釋比的樣品中,凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效,計算結果時,應取平均值。
(3)培養過程中應經常檢查培養瓶封口的水,及時補充,避免干涸。